Mehanizmi popravka pogreške kod aminoacil-tRNA-sintetaza razreda I
Mechanisms of proofreading by class I aminoacyl-tRNA synthetases
Voditelji / Principal Investigators:
Prof. John J. Perona, University of California at Santa Barbara, Santa Barbara, US
doc. dr. sc. Ita Gruić-Sovulj, Kemijski odsjek, PMF
Financiranje/Funding:
FIRCA-NIH (RTW008024A)
Suradnici / Collaborators:
Morana Dulić, dipl. ing. biol.
Nevena Cvetešić, student
Sažetak:
Aminoacil-tRNA-sintetaze (aaRS) su enzimi koji kataliziraju kovalentno povezivanje odgovarajućeg para aminokiseline i tRNA mehanizmom koji uključuje nastajanje aminoacil-adenilatnog međuprodukta. Sposobnost ove skupine enzima da povežu isključivo pripadni par aminokiseline i tRNA presudna je za točnost biosinteze proteina, a time i za život stanice. Neke aaRS ne mogu razlikovati strukturno slične aminokiseline s dovoljno visokim stupnjem točnosti, te aktiviraju i prenose nepripadnu aminokiselinu na tRNA. Ti enzimi posjeduju dodatnu enzimsku aktivnost kojom hidroliziraju nepripadni aminoacil-adenilat (popravak prije prijenosa) i/ili tRNA aciliranu nepripadnom aminokiselinom (popravak poslije prijenosa).
Pokazano je da se popravak poslije prijenosa događa unutar hidrolitičkog mjesta koje se nalazi na prostorno odvojenoj domeni. Riješene kristalne strukture podupiru model po kojem se jednolančani 3'-kraj aminoacilirane tRNA premješta iz sintetičkog u hidrolitičko aktivno mjesto udaljeno 30 Å. Na temelju toga, pretpostavljeno je da se i hidroliza nepripadnog aminoacil-adenilata također događa u udaljenom hidrolitičkom mjestu iako riješene strukture proteina ne ukazuju na moguću putanju kojom bi aminoacil-adenilat prešao put od 30 Å bez disocijacije s enzima.
Osnovni cilj ovog projekta je istražiti mehanizme hidrolitičkog popravka izoleucil- i valil-tRNA-sintetaze iz bakterije Escherichia coli. Posebno zanimljiva pitanja su: (i) da li je tRNA nužan kofaktor popravka prije prijenosa i ako da, koja je njezina uloga? (ii) gdje se događa hidroliza nepripadnog aminoacil-adenilata? (iii) da li se razlikovanje pripadne aminokiseline od nepripadne događa i kroz konformacijsku prilagodbu enzima i tRNA tijekom aminoacilacije i/ili premještanja iz sintetičkog u hidrolitičko mjesto? Niz analoga tRNA te mutanata proteina koji imaju narušeno hidrolitičko mjesto bit će pripremljeni i kinetički analizirani. Koristeći metodu brzog gašenja protoka, koja omogućava praćenje reakcije u vrlo kratkom vremenskom intervalu, odredit će se koeficijenti brzine pojedinačnih koraka reakcijskog mehanizma. Konformacijske promjene enzima i tRNA, koje se događaju prilikom reakcije aminoaciliranja i/ili popravka, pratit će se kroz promjenu intenziteta fluorescencije triptofana i/ili obilježene tRNA u prisutnosti pripadne odnosno nepripadne aminokiseline. Dobiveni podaci omogućit će bolji uvid u temeljne principe enzimske selektivnosti pri izboru i procesiranju vlastitih supstrata i objasniti mehanizam popravka pogreške prije prijenosa. Instrument brzog gašenje protoka nalazi se u našem laboratoriju dok je fluorimetar zaustavljenog protoka dostupan u grupi prof. Perone.
Summary:
Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) are enzymes that catalyze covalent attachment of cognate amino acid to tRNA via aminoacyl-adenylate intermediate pathway. The ability of these enzymes to match only cognate pair of amino acid and tRNA is essential for accurate protein biosynthesis and thus cell survival. Some aaRS cannot distinguish between structurally similar amino acids with high accuracy, and thus activate and transfer noncognate amino acid to tRNA. However, the noncognate aminoacyl-adenylate and aminoacyl-tRNA are destroyed by additional hydrolytic activities of the enzymes (pre- and post-transfer editing or proofreading, respectively).
Hydrolysis of the noncognate aminoacylated tRNA (post-transfer editing) occurs in a spatially separate editing domain. Crystal structures support a model whereby the single stranded 3'-end of the aminoacyl-tRNA is translocated from the synthetic to the hydrolytic site some 30 Å distant. Hydrolysis of the noncognate aminoacyl-adenylate (pre-transfer editing) has been assumed to occur at the same remote hydrolytic site and shuttling of the intermediate was therefore proposed. However, crystal structures have never corroborated the existence of the shuttling pathway.
The major goal of this project is to elucidate mechanisms of editing activities of isoleucil- and valyl-tRNA synthetases from Escherichia coli. The following questions will be addressed: (i) does pre-transfer editing require tRNA and if it does what is its role? (ii) where does the hydrolysis of noncognate aminoacyl-adenylate take place? (iii) does amino acid discrimination operate through conformational readjustment of both synthetase and tRNA during aminoacylation and/or translocation step? Several tRNA analogues as well as enzyme mutants with disrupted hydrolytic site will be produced and kinetically characterized. Rate constants for individual steps of the reaction mechanism will be determined using rapid chemical quench. Conformational readjustments associated with aminoacylation and/or proofreading will be followed by monitoring changes in tryptophane and/or labeled tRNA fluorescence in the presence of cognate and noncognate amino acid as well. Obtained results will allow better insight in the basic principles of enzyme's selectivity toward cognate substrates and explain mechanism of pre-transfer proofreading.
