VANJA TADIĆ – OBRANA DOKTORSKOG RADA
Naslov: Construction of molecular tools based on CRISPR/Cas9 system for epigenetic modulation of gene expression
Konstrukcija molekularnih alata temeljenih na sustavu CRISPR/Cas9 za epigenetičku modulaciju ekspresije gena
ponedjeljak, 28. siječnja 2019. godine u 11,00 sati u dvorani Fizikalno-kemijski seminar Biološkog odsjeka Prirodoslovno-matematičkog fakulteta, Horvatovac 102a, Zagreb
Povjerenstvo za obranu:
doc. dr. sc. Aleksandar Vojta, PMF Zagreb
prof. dr. sc. Srećko Gajović, MF Zagreb
dr. sc. Melita Vidaković, znan. savj., Institut za biološka istraživanja „Siniša Stanković“, Sveučilište u Beogradu, Republika Srbija
Mentor: prof. dr. sc. Vlatka Zoldoš, PMF, Zagreb
U ovom radu napravila sam C-terminalnu fuziju katalitičke domene proteina TET1 (Ten-Eleven Translocation 1) i katalitički inaktivne nukleaze Cas9 (dCas9) izolirane iz vrste Streptococcus pyogenes i konstruirala dCas9-TET1 molekularni alat za ciljanu demetilaciju DNA. Testirala sam i aktivnost N-terminalne fuzije TET1-dCas9. Protein TET1 katalizira pretvorbu 5-metilcitozina u 5-metilhidroksicitozin, što predstavlja prvi korak u aktivnoj demetilaciji DNA. Korelacijske analize povezuju hipermetilirane CpG dinukleotide u promotorima gena s represijom transkripcije, a hipometilirane CpG dinukleotide s aktivnom transkripcijom. Konstruirani alati uspješno su upotrijebljeni za ciljanu demetilaciju CpG dinukleotida unutar promotora kandidat gena MGAT3 i LAMB1. Pokazala sam da je nakon demetilacije ciljanih CpG mjesta u promotoru gena MGAT3 porasla razina transkripata ovoga gena.Usporedila sam efekt aktivacije gena MGAT3 postignut ciljanom demetilacijom dCas9-TET1 alatom s konzervativnijim pristupom direktne aktivacije pomoću VPR-dCas9 alata. U ovu svrhu upotrijebila sam N-terminalnu fuziju aktivacijske domene VPR i dCas9 iz vrste Staphylococcus aureus (dSaCas9).
Primjena molekularnih alata za ciljanu demetilaciju CpG dinukleotida omogućava izravnu analizu utjecaja metilacije DNA na ekspresiju gena od interesa i pokazuje je li ciljana regija DNA regulatorna. Konstrukcija modularnih alata temeljenih na sustavu CRISPR/Cas9 omogućuje jednostavnije epigenetičko inženjerstvo. Ciljana demetilacija specifičnih regija u genomu ima potencijal u reprogramiranju stanica pomoću promijenjenog uzorka ekspresije gena i time je neprocjenjivo koristan pristup u razjašnjavanju bioloških puteva u stanici.
Pristupačnost