Nika Foglar

Obrana će se održati u ČETVRTAK, 21. ožujka 2024. godine u 11.00 sati u dvorani D2,  Biocentar, Borongajska cesta 83h, Zagreb

Disertacija nosi naslov: Effects of simultaneous manipulation of DNA and histones on the expression of genes involved in epithelial-mesenchymal transition using CRISPR/dCas9 system

Utjecaj istovremene manipulacije DNA i histona na ekspresiju gena uključenih u epitelno-mezenhimsku tranziciju primjenom sustava CRISPR/dCas9

Povjerenstvo za obranu imenovano je u sastavu:

1. Prof. dr. sc. Nataša Bauer, PMF, Zagreb
2. Doc. dr. sc. Rosa Karlić, PMF, Zagreb
3. Dr. sc. Oliver Vugrek, znan. savjetnik, Institut Ruđer Bošković

Zamjena: prof. dr. sc. Jasminka Štefulj, znan. savj., Institut Ruđer Bošković / Hrvatsko katoličko sveučilište

Mentor: prof. dr. sc. Vlatka Zoldoš, PMF, Zagreb 

Summary:

Interplay between epigenetic modifications is essential for regulation of gene expression. The adaptation of CRISPR/Cas9 technology for epigenetic research by introducing dead Cas9 (dCas9) fused to epigenetic effector domains (ED) has enabled significant advancements in this field. I expanded the CRISPR/dCas9 modular system with five histone modifying domains (G9a, G9a-me3, LSD1, KDM5A, macro1.1) and DNMT3L domain, as well as the multi-guide module to accommodate up to 11 gRNAs. From a set of candidate genes involved in epithelial to mesenchymal transition (EMT), ZEB1 and SNAI1 were selected for further epigenetic manipulations in HepG2 cell line. Their CpG islands were simultaneously targeted with dCas-DNMT3A combined with specific dCas9-ED fusions to understand the interplay of DNA methylation and histone modifications. The combinations had synergistic effect on gene expression and affected the EMT phenotype. Interplay between introduced modifications was also observed as a locus specific synergistic increase in DNA methylation, and was not disrupted by global histone acetylation increase after sodium butyrate treatment. The combinatorial epigenetic effects were not replicated in A549 cell line, suggesting specificity of epigenetic regulatory pathways.

Sažetak:

Međudjelovanje epigenetičkih modifikacija je neophodno regulaciju ekspresije gena. Korištenje CRISPR/Cas9 tehnologije u epigenetičkim istraživanjima pomoću inaktivnog Cas9 (dCas9) fuzioniranog s epigenetičkim efektorskim domenama (ED) omogućilo je značajan napredak u ovom području. Proširila sam modularni sustav CRISPR/dCas9 s pet domena za modifikaciju histona (G9a, G9a-me3, LSD1, KDM5A, makro1.1) i domenom DNMT3L, te „multi-guide“ modul koji može primiti do 11 gRNA. Od nekoliko kandidat gena koji sudjeluju u epitelno-mezenhimskoj tranziciji (EMT), odabrala sam ZEB1 i SNAI1 za daljnje epigenetičke manipulacije u staničnoj liniji HepG2. Njihovi CpG otoci su istovremeno ciljani s DNMT3A-dCas9 u kombinaciji s određenom dCas9-ED fuzijom kako bi se istražilo među-djelovanje DNA metilacije i modifikacija histona. Kombinacije su imale sinergistički učinak na ekspresiju gena i utjecale su na EMT fenotip. Simultano uvedene modifikacije pokazale su sinergistički efekt na razini metilacije DNA na određenom lokusu, koji nije bio osjetljiv na povećanje globalne acetilacije histona. Kombinacije dCas9 fuzija nisu djelovale na ekspresiju ciljanih gena u A549 staničnoj liniji, što ukazuje na specifičnost epigenetičkih regulatornih putova.