Anika Mijakovac - Obrana doktorskog rada

Naslov:

Cell lines with integrated CRISPRa and CRISPRi system and their application in analysis of immunoglobulin G glycosylation

Stanične linije s integriranim CRISPRa i CRISPRi sustavom i njihova primjena u analizi glikozilacije imunoglobulina G

Ponedjeljak, 20. ožujak 2023. u 17,00 h u dvorani 2 Biocentra, Borongajska cesta 83H, Zagreb

Povjerenstvo za obranu:

Prof. dr. sc. Vlatka Zoldoš, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb

Izv. prof. dr. sc. Ivana Ivančić Baće, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb

Prof. dr. sc. Gestur Vidarsson, Utrecht University, Department of Pharmaceutical Sciences, Nizozemska

Zamjena:

Prof. dr. sc. Gordan Lauc, Farmaceutsko-biokemijski fakultet, Zagreb

Mentor: izv. prof. dr. sc. Aleksandar Vojta, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb

Sažetak:

Regulatorni mehanizmi glikozilacije imunoglobulina G (IgG) većinom su nepoznati. Kako bismo proveli funkcionalnu potvrdu uloge gena asociranih s IgG glikozilacijom razvili smo sustav HEK293-F. Korištenjem transpozona, ugradili smo kazete dCas9-VPR/dCas9-KRAB u genom stanica FreeStyle™ 293-F za ciljanu manipulaciju (CRISPRa/CRISPRi) odabranih gena. Transfekcija stanica HEK293-F s plazmidom IgG-gRNA omogućila nam je istovremenu analizu ekspresije gena i IgG glikoma. Korištenjem ovog sustava potvrdili smo ulogu lokusa SPPL3 u IgG sijalinizaciji. Aktiviranjem gena reguliranih estrogenom, RUNX3 i SPINK4, došlo je do smanjenja galaktoziliranih IgG glikoformi odnosno pojave fenotipa karakterističnog za menopauzu i starenje. Kako bismo dodatno istražili opseg genetičkih utjecaja na IgG glikozilaciju tijekom starenja, proveli smo analizu nasljednosti markera biološke dobi – glikanskog sata. Nasljednost glikanskog sata se pokazala visokom nakon korekcije za dob sudionika (~71%) čime smo pokazali kako je neophodno razvijati nove tehnologije koje će razjasniti genetičke faktore uključene u regulaciju glikozilacije IgG-a, povezane ne samo s bolestima već i sa starenjem.

Ključne riječi: glikozilacija, imunoglobulin G, CRISPR/dCas9, regulacija gena, nasljednost

Mechanisms regulating immunoglobulin G (IgG) glycosylation are largely unknown. To perform functional validation of genes implicated in IgG glycosylation we developed the HEK293-F system. Utilizing transposons, we integrated dCas9-VPR/dCas9-KRAB expression cassettes in the genome of FreeStyle™ 293-F cells for targeted manipulation (CRISPRa/CRISPRi) of selected genes. Transfection of HEK293-F cells with IgG-gRNA-bearing plasmid enabled simultaneous analysis of gene expression and IgG glycome. Utilizing this system, we validated the role of the SPPL3 locus in IgG sialylation. Activation of estrogen-regulated genes, RUNX3 and SPINK4, decreased the galactosylated IgG glycoforms, a phenotype characteristic of menopause and aging. To further examine the magnitude of genetic influences on IgG glycosylation in aging we performed a heritability analysis on the glycan clock marker of biological age. Heritability of the glycan clock, when corrected for the age of the individuals, proved to be high (~71%). This served to demonstrate the necessity to develop new technologies able to dissect the observed genetic factors regulating IgG glycosylation associated not only with disease but also with aging.

Keywords: glycosylation, immunoglobulin G, CRISPR/dCas9, gene regulation, heritability